Laporan Praktikum Pewarnaan Gram

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA GIZI

PEWARNAAN GRAM

 

DISUSUN OLEH :

1. RUSMAH SUCI ARIYANI (J310120024)

2. FIQI DWI KARTIKA         (J310120023)

PROGRAM STUDI ILMU GIZI S1

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA

2014

I.                   Judul    : Pewarnaan Gram dan Pengamatan Morfologi Bakteri

II.                Tujuan

Mengetahui dan memehami prosedur pewarnaan gram dan  mengelompokkan bakteri kedalam kelompok gram positif atau bakteri gram negativ serta menentukan morfologinya.

III.             Pendahuluan 

               Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.

                       

Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Rudi, 2010).

         

         Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006).

         
 

 

IV.             Tinjauan Pustaka

Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

a.  Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b.  Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negative (Manurung, 2010).

Sifat	Bakteri garam (+)	Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah (1-4%)	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitif	Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi	Kebanyakan spesies relatif kompleks	Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).

Klasifikasi Bacillus subtilis. (itis, 2008)

Kingdom : Bakteri

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Order : Bacillales

Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis

Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif. Bakteri ini tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam amino. Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor (Schaechter 2006).

Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).

Klasifikasi E. Coli

Kingdom : Bakteria
Filum   : Proteobacteria
Kelas   : Gamma Proteobacteria
Order   : Enterobacteriales
Famili  : Enterobacteriaceae
Genus   : Escherichia
Spesies : E.  coli

Menurut literatur, E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik uremic (hus), infeksi usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis. Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Fajriana, 2008).

V.                Metode Praktikum

a.       Alat dan Bahan

Alat

1.      Mikroskop

2.      Objek glass

3.      Jarum inokulasi

4.      Busen

5.      Penjepit

6.      Pipet tetes

Bahan

Pewarnaan Gram

1.      Biakan bakteri murni (E. Coli)                                    6. Gram D (Safranin)

2.      Gram A (Carbol Getain Violet)                                  7. Kapas

3.      Gram B (Iodium)                                                        8. Minyak Imersi

4.      Gram C (Alkohol)                                                       9. Air

Morfologi Bakteri

1.      Preparat awetan

2.      Alcohol 70%

3.      Minyak imersi

4.      Kapas

b.      Cara kerja

1.      Pewarnaan Gram

Pengambilan objek glass dan fiksasi dengan meleidah apikan di atas busen sebanyak 2-3 kali secara cepat

Pengambilan 1 ose biakan murni (E. Coli) dan diletakan di atas objek g;lass

Perataan biakan murni dengan jarum ose

Pemfiksasian dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas busen 2-3 kali dengan cepat

Penuangan pewarnaan carbol getain violet, biakan selam 1 menit

 

Pembuangan sisa carbol getain violet

Pencucian preparat dengan air mengalir

 

Pengeringan preparat dengan membiarkan di udara terbuka/di hair drier

Penuangan pewarna iodium, biakan selam 2 menit

 

Pembuangan sisa iodium

Pencucian preparat dengan air mengalir

Pengeringan preparat di udara terbuka

 

Pemucatan dengan alcohol 70% dengan cara menetesakan perlahan sampai warna ungu hilang

 

Pembilasan dengan air mengalir

 

Penuangan pewarna safranin sebagai pewarna penutup/pembanding biarkan selam 30 detik

Pembuangan kelebihan safranin

 

Pencucian preparat dengan air mengalir

 

Dikeringkan preparat denngan kertas isap

 

Penambakan minyak imersi pada preparat dan pengamatan preparat di bawah mikroskop denga pembesarna lemah kemudian dengan pembesaran kuat

2.      Morfologi Bakteri

Pengambilan preparat awetan dari berbagai bakteri

 

Pemasangan dibawah mikroskop

 

Pengamatan dengan pembesaran 10X sampai didapatkan lapang pandang dan focus yang pas

Penambahan minyak imersi di atas preparat

 

Pengubahan perbesaran menjadi 100X

 

Penggambaran dan penggolongan bakteri yang sedang diamati

VI.             Hasil Praktikum

No	Jenis Bakteri	Gambar	Keterangan
1.	E. Coli		Biakan murni yang diguanakan E. Coli namun dalam pengamatan ternyata terlihat bakteri Basillus. Hal ini terjadi mungkin karena adanya kontaminasi sehingga dalam preparat terdapat bakteri Basillus. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang letaknya di tengah.

VII.          Pembahasan

Pada praktikum kali ini kami melakukan pewarnaan gram dan pengamatan morfologi bakteri. Biakan murni yang digunakan yaitu E. Coli. Namun pada pratikum ini setelah dilakukan pengamatan ternyata yang terlihat pada mikroskop ternyata bakteri Basillus. Hali ini terjadi mungkin karena sudah terjadi kontaminasi sehingga bakteri yang terdapat dalam pengamatan adalah Basillus. Sehingga dalam pembahasan praktikum ini kami lebih banyak membahas bakteri Basillus dari pada E. Coli. Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol. 

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan gram menggunakan 4 macam zat pewarna yaitu meliputi Cibol Getian Violet sebagai pewarna primer, Iodium sebagai pewarna sekunder, Alkohol sebagai larutan pemucat, Safranin sebagai pewarna pembanding. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 

 Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. 

Umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat sulit sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati (Karmana 2007). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat pewarna penutup.

Pada praktikum kali ini dilakukan teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada bakteri. Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (Bacillus SP) dengan tujuan agar isolat bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk melekatkan mikroorganisme di kaca preparat. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk memperkuat warna pada bakteri. Alkohol 96% berfungsi sebagai pemucat atau peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu pemberian safranin yang berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah kehilangan warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol. Pada bakteri di preparat menunjukkan warna ungu. Hal ini membuktikan bahwa bakteri di preparat merupakan bakteri gram positif dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan kristal ungu. Jika berwarna merah muda menunjukan bakteri gram negatif dikarenakan pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan safranin.

Hasil uji bakteri agar miring atau Bacillus sp dapat mempertahankan warna primernya walaupun  mengalami dekolorisasi(pencucian) ketika ditambahkan alkohol sehingga bakteri Bacillus sp merupakan kelompok bakteri gram positif. Prinsip pewarnaan gram didasarkan  pada perbedaan struktur dinding sel sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan perbedaan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjosapuro 2005).

VIII.       Kesimpulan

Setelah melakukan praktikum ini kami dapat mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan pengelompokan bakteri. Basillus merupakan bakteri gram positif, dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan kristal ungu. Sehingga pada saat sampai pewarnaan terakhir bakteri berwarna biru atau ungu.

IX.             Daftar pustaka

Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. http : // mushoffaditya. blogspot.   com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 2 Juni 2014.

Dwidjoseputro.2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:PT Gramedia

Fajriana, Rizki. 2008. Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram. http //pewarnaan bakteri\Mikroum…Pewarnaan Gram « RIZQI FAJRIANA BLOG’S.htm/. 11 November 2010.

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif). http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.

Karmana.2007.Biologi.Jakarta:PT Grafindo Media Pratama

Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. http: //pebrinmanurung. blogspot. com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri. html. 11 November 2010.

Pelezar chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta

Reyza, Muhammad. 2008. Metode Pewarnaan Gram. http: //qi206. wordpress. Com/ 2008/10/17/ mikroba/pewarnaan/ 11 November 2010.

Rudi, 2010. Bakteri Gram dan Pewarnaannya. http: // rudyregobiz. wordpress.com/ bakteri-gram-dan-pewarnaannya-2/. 11 November 2010.

Suriawiria. 2005. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.